Vitamin B12

Quellen und Bedarf

Resorption

Cobalamin-bindende Proteine im Blut 

Aufnahme in die Zellen und Speicherung

Synthese

Struktur und Varianten

Cobalamin-Enzyme im Vergleich

Mechanismus der Methioninsynthase

Mechanismus der Methylmalonyl-CoA-Mutase

Komplementationsgruppen

 

Quellen und Bedarf

Menschen beziehen Vitamin B12 (Cobalamin) aus Nahrungsmitteln tierischen Ursprungs. Eine hohe Vitamin-B12-Nährstoffdichte, das ist der Gehalt an Cobalamin im Verhältnis zum Brennwert des Lebensmittels, haben Leber, Muskelfleisch, Fisch, Eier, Milch und Käse (Die Nährstoffdichte nimmt in der Reihenfolge ab). Pflanzliche Produkte sind praktisch frei von Vitamin B12. Leguminosen können wegen ihrer Knöllchenbakterien Spuren von Cobalamin enthalten. Pflanzliche Lebensmittel, die mit Hilfe von Milchsäurebakterien hergestellt werden, enthalten ebenfalls Spuren des Vitamins. Diese Mengen reichen jedoch bei ausschließlich vegetarischer Ernährung nicht zur Deckung des Bedarfs. 

Der Bedarf an Vitamin B12 wird mit 2,4 µg täglich angegeben. Allerdings führen 4 µg bis 7 µg pro Tag noch zu einer weiteren Verringerung des Methylmalonsäurespiegels [1]. Methylmalonsäure und Homocystein steigen bei Vitamin-B12-Mangel an und eignen sich auch für dessen Nachweis.

Resorption 

  • Proteinhaltige Nahrungsmittel lösen in Speicheldrüsen der Mundhöhle die Sekretion des säurefesten Glykoproteins Haptocorrin und im Magen die Bildung von der Protease Pepsin aus.
  • Die Parietalzellen bilden Magensäure und den Intrinsic Factor. Säure und Enzym spalten das Protein und lösen das Cobalamin heraus.
  • Haptocorrin bildet mit Cobalamin einen säureresistenten Komplex. Der Intrinsic Factor wird erst im Duodenum gebraucht. Dort setzt die Protease Trypsin Cobalamin aus dem Komplex mit Haptocorrin frei und Cobalamin bindet an den Intrinsic Factor. Der Intrinsic Factor hat eine höhere Affinität zu Cobalaminen, die der Mensch nutzen kann, als zu anderen in der Nahrung vorkommenden Vitamin-B12-ähnlichen Verbindungen. 
  • Im terminalen Ileum wird der Komplex von von Cubilin, einem Bestandteil des Cubam-Rezeptors auf Darm-Mukosazellen, erkannt. Der Komplex wird über rezeptorvermittelte Endozytose in die Zelle aufgenommen. Das Endosom fusioniert mit einem Lysosom, der Intrinsic Factor wird abgebaut und Cobalamin gelangt ins Zytoplasma der Darmzelle dort bindet es an Transcobalamin II. Dieser Komplex wird dann mit dem ATP-abhängigen Transporter ABCC1 (auch Multidrugresistence Protein 1) an der basolateralen Membran des intestinalen Epithels ausgeschleust und gelangt ins Pfortaderblut. 

Gibt man hohe Dosen Vitamin B12 oral, gelangen geringe, aber häufig ausreichende Mengen davon auch ohne Intrinsic Factor ins Blut. Auch der Ablauf dieses Prozesses ist noch unklar.

Cobalamin-bindende Proteine im Blut

Der Komplex aus Transcobalamin II und Cobalamin wird Holotranscobalamin II (HoloTCII) genannt und ist das Cobalamin im Blut, das Zellen mit ihrem TC-II-Rezeptor aufnehmen können. Holo-TCII ist ein kleines Protein von 50.193 Dalton. Es wird in der Niere glomerulär filtriert und mit Hilfe des Rezeptors tubulär rückresorbiert. Der tägliche Verlust über den Urin beträgt unter 1 µg Cobalamin. 

Von dem im Labor bestimmten Gesamt-Cobalamin bzw. "Gesamt-Vitamin-B12" stellt HoloTC II lediglich 6% bis 20%. Die größere und stark schwankende Fraktion ist Haptocorrin (Transcobalamin I) dessen Funktion außerhalb des Magens noch unbekannt ist. Eine Hypothese ist, dass Haptocorrin Cobalamin-ähnliche Verbindungen oder unvollständiges Cobalamin bindet (z. B. ohne Dimethylbenzimidazol) und abfängt.

Die Halbwertszeit von HoloTC II im Plasma beträgt 1–2 Stunden, während Haptocorrin eine Halbwertszeit von ca. 9 Tagen hat. Die Cobalamin-bindenden Proteine in Muttermilch, Erythrozyten, das Transcobalamin I im Plasma und Transcobalamin III in Leukozyten sind letztlich Haptocorrine, haben aber möglicherweise unterschiedliche Aufgaben. 

Bei einigen Krebs-, Leber- und Nierenerkrankungen wurden extrem hohe Gesamt-Cobalaminmengen im Blut nachgewiesen, die sich nicht durch Ernährung oder Supplemente erklären lassen [3]. Daten der dänischen Arbeitsgruppe, die seit Jahren an diesem Thema arbeitet, deuten darauf hin, dass diese Laborwerte durch einen extrem hohen Haptocorrin-Anteil zustande kommen [4-5]. Wie es dazu kommt ist unbekannt. Man weiß aber, dass einige Tumore Haptocorrin exprimieren. Die dänischen Wissenschaftler sehen in solchen extremen Gesamt-Cobalamin-Spiegeln einen frühen Risikomarker und schlagen vor, bei betroffenen Patienten zuerst nach Neoplasien und dann nach Leber- und Nierenerkrankungen zu suchen [6].

[1] Bor MV et al.: Daily intake of 4 to 7 microg dietary vitamin B-12 is associated with steady concentrations of vitamin B-12-related biomarkers in a healthy young population. Am J Clin Nutr 2010 

[2] Marianne J. Nielsen, Mie R. Rasmussen, Christian B. F. Andersen, Ebba Nexø & Søren K. Moestrup. Vitamin B12 transport from food to the body's cells - a sophisticated, multistep pathway. Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology 2012, 9, 345-354.

[3] Arendt JF, Pedersen L, Nexo E, Sørensen HAT. Elevated plasma vitamin B12 levels as a marker for cancer. a population-based cohort study. J Natl Cancer Inst 2013, 105(23).1799-805.

[4] Arendt JF, Nexo E. Cobalamin related parameters and disease patterns in patients with increased serum cobalamin levels.PLoS One 2012;7(9).e45979.    

[5] Lildballe DL, Nguyen KQ, Poulsen SS, Nielsen HO, Nexo E. Haptocorrin as marker of disease progression in fibrolamellar hepatocellular carcinoma. Eur J Surg Oncol 2011 37(1).72-9.

[6] Arendt JF, Nexo E. Unexpected high plasma cobalamin, proposal for a diagnostic strategy. Clin Chem Lab Med 2013, 51(3).489-96 Review.

Aufnahme in die Zellen und Speicherung

In die Zellen gelangt HoloTC II durch rezeptorvermittelte Endozytose.

Das Endosom fusioniert mit einem Lysosom, wo das bindende Protein abgebaut und Cobalamin freigesetzt wird. Auschließend wird es ins Zytoplasma überführt

Die Umwandlung zu Methylcobalamin (Methioninsynthase) erfolgt im Zytoplasma, die zu 5'-Desoxyadenosyl-Cobalamin (Methylmalonyl-CoA-Mutase) in den Mitochondrien.

Eine hohe Rezeptordichte für HoloTC II haben Leber, Muskulatur und Niere. Diese Organe speichern auch viel Cobalamin. 

Der Gesamtbestand an Cobalamin im Körper liegt bei etwa 3 bis 5 mg. Den größten Anteil hat die Leber. Sie gibt 3-8 µg Cobalamin pro Tag in die Galle ab. Der größte Teil davon wird im Ileum wieder resorbiert. Der enterohepatische Kreislauf ist ein dynamischer Speicher für Cobalamin. 

Das HoloTC-II aus dem Blutkreislauf bindet an einen dafür spezifischen Rezeptor in der Zellmembran. Der Komplex wird rezeptorvermittelt endozytiert. Das Endosom fusioniert mit einem Lysosom. Dort wird Transcobalamin-II abgebaut, Cobalamin freigesetzt und ins Zytoplasma transportiert. Dort wird es nach heutigem Kenntnisstand von den Cobalt-Liganden, also Methyl-, Adenosyl-, Cyanid- und Hydroxyl-Resten befreit und das Cobalt in den zweiwertigen Zustand gebracht.

Von der Methioninsynthase gebundenes Co2+-Cobalamin wird zunächst von einer Methioninsynthase-Reduktase mit NADPH und S-Adenosyl-Methionin zu Co+-Cobalamin reduziert. In diesem Oxidationszustand erfolgt dann die reduktive Methylierung des Cobalts mit 5-Methyltetrahydrofolat, wobei das Cobalt+ zu Cobalt3+ oxidiert wird (s. Grafik unten).

Die Übertragung des 5‘-Desoxyadenosylrests auf das Cobalamin erfolgt durch das homotrimere Enzym „ATP-abhängige Co1+-Cobalamin Adenosyltransferase“ (ATR). Dieses Enzym überträgt den fertigen Kofaktor 5'Adenosylcobalamin (haüfig AdoCbl abgekürzt) auch auf die Methylmalonyl-CoA-Mutase

Gherasim C, Lofgren M, Banerjee R. Navigating the B(12) road: assimilation, delivery, and disorders of cobalamin. J Biol Chem 2013;288(19):13186-93.

Synthese von Cobalamin

Cobalamin kann nur von Bakterien synthetisiert werden. Es wird auch von Darmbakterien im Dickdarm produziert. Menschen resorbieren Cobalamin jedoch im terminalen Ileum. Das von den Darmbakterien im Colon produzierte Cobalamin kann nach heutigem Kenntnisstand nicht oder nur ungenügend resorbiert werden.

Struktur und Varianten

Vitamin B12

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Das Formelbild stammt von der Wikibooks-Seite WIBO Biochemie: http://de.wikibooks.org/wiki/Datei:Cobalamin.svg

In den beiden Cobalaminen des Menschen, die als prosthetische Gruppen der Methioninsynthase bzw. Methylmalonyl-Coenzym-A-Mutase dienen (Methylcobalamin bzw. 5‘-Desoxyadenolsyl-Cobalamin),  wird das Kobalt von vier Stickstoff-Elektronenpaaren koordiniert. Sie stammen von den vier Pyrrolringen, die den für Cobalamine typischen ebenen Corrinring bilden. Die „unter“ dieser Ebene liegende alpha-Position des Kobalts wird von der Base 5,6-Dimethylbenzimidazol (DMB) koordiniert, allerdings nur, wenn die Cobalamine frei in Lösung, also nicht an das jeweilige Enzym gebunden im sind.

Im aktiven Enzym wird die alpha-Koordinierungsstelle des Kobalts von einem Histidin koordiniert, also einer Aminosäure, die wie DMB einen Imidazol-Ring hat. Es gibt noch einen Zwischenzustand "base-off" genannt, in dem dort ein Wassermolekül koordiniert ist.

In den beiden Enzymen des Menschen sind die beta-Substituenten am Kobalt (R in der Molekülstrutur oben) 5'-Desoxyadenosin oder -CH3; eine Methylgruppe. Ansosten können an die  „obere“ beta-Position Hydroxyl- und Cyano-Gruppen binden. 

5'-Desoxyadenosin ist ein "ungewöhnliches" Desoxyribonukleosid, bei dem nicht, wie bei Nukleosiden für die DNA-Synthese, die 2'-OH-Gruppe desoxyliert wurde, sondern die 5'-OH-Gruppe des Ribose-Rings.

Die Cobalamin-bindenden Enzyme im Vergleich

 

 

Cobalamin-Enzyme des Menschen

 

Enzym

Methioninsynthase

(5-Methyl-Tetrahydrofolat-Homocystein-Methyltransferase)

Methylmalonyl-CoA-Mutase

(L-Methylmalonyl-CoA-Succinyl-CoA-Mutase)

Kofaktor

(prosthetische Gruppe)

Methylcobalamin

5‘-Desoxy-Adenosylcobalamin (AdoCbl)

 

Zelluläre Lokalisation

Zytoplasma

Mitochondrien

Biochemische

Reaktionen

Methylierung von Homocystein (Hcy) zu Methionin:

2 Schritte (nukleophile Substitutionen)

 

1. Die Bindung zwischen Co3+ und der Methylgruppe, des Methylcobalamins wird hetereolytisch gespalten (beide Elektronen werden dem Cobalt zugeordnet, Co3+ wird also zu Co+ reduziert. Das Prinzip ist ein nukleophiler Angriff des Homocystein-Thiolats (–S-) auf die an Cobalt gebundene Methylgruppe.

 

2. Reduktive Methylierung des Co+  mit der Methylgruppe des mit N5-Methyl-Tetrahydrofolats. Dabei wird das Co+  wieder zu Co3+ oxidiert. Damit ist die Methioninsynthase wieder bereit für die Methylierung von Homocystein. Tetrahydrofolat wird in den allgemeinen Folatstoffwechsel zurückgeführt

Isomerisierung von Methylmalonyl-CoA zu Succiniyl-CoA:

Das Enzym reduziert das Co3+ seines Kofaktors 5‘-Desoxy-Adenosylcobalamin zu Co2+, indem es die Elektronenpaarbindung zwischen der 5‘-CH2-Gruppe und Co3+ homolytisch spaltet. Dabei entsteht aus der 5‘-Methylgruppe des 5‘-Desoxyadenosyl-Cobalamins ein Radikal (also mit einem Elektron).

Das Radikal entzieht der Methylgruppe des Methyl-Malonyl-CoA ein Wasserstoffatom (also mit "seinem" Elektron). Das führt zur Bildung eines Methyl-Malonyl-CoA-Radikals. Die CO-S-CoA-Gruppe und das ungepaarte Elektron tauschen dann ihre Position. Damit ist die CO-S-CoA an die Methylgruppe des Moleküls gebunden und ein Succinyl-CoA-Radikal entstanden. Dessen ungepaartes Elektron entzieht der 5‘-Methylgruppe des 5‘-Desoxyadenosyl-Cobalamins ein Wasserstoffatom (mit Elektron), woraufhin wieder ein 5‘-Desoxyadenosyl-Cobalamin entsteht. Das entzieht dem Co2+ ein Elektron, so dass wieder Co3+ entsteht. Damit kann der Zyklus von vorn beginnen. Der gesamte Prozess wird von einer einer GTPase, (Chaperone) „betreut“. Die GTP-Hydrolyse der GTPase liefert auch einen Teil der Energie für die Redaktionen.

Regeneration des Kofaktors

 

Co+ des Cobalamins, das nach der Synthese des Methionins vorliegt, ist oxidationsempfindlich und oxidiert spontan zu Cobalt2+.

Das Enzym Methioninsynthase-Reduktase reduziert das Cobalt2+ des Cobalamins mit Hilfe von NADPH, FADH und S-Adenosyl-Methionin, wobei Co+-Cobalamin und S-Adenosylhomocystein entstehen

Das 5‘-Desoxy-Adenosylcobalamin-Radikal verliert gelegentlich den 5‘-Desoxy-Adenosylrest. Die Mutase mit Co2+-Cobalamin ist dann inaktiv. Sie kann wieder reaktiviert werden, indem das Co2+-Cobalamin aus dem Enzym entfernt wird. Auch dies wird von o. g. GTPase gesteuert.

Anschließend wird von der Adenosyltransferase neu synthetisiertes 5‘-Desoxy-Co3+Adenosylcobalamin in das Enzym Methylmalonyl-CoA-Mutase eingebaut. Die Adenosyltransferase katalysiert die Synthese des Kofaktors 5‘-Desoxy-Adenosylcobalamin und den Einbau in das Enzym in Kooperation mit der o. g. GTPase.

Bedeutung

C1-Stoffwechsel und Biosynthesen

Synthese von Methionin

Zum Abbau von Homocystein

Aminosäure für Proteinsynthese

Als Substrat für die Synthese von S-Adenosylethionin (SAM; Kosubstrat für fast alle Methyltransferasen)           

Rückführung von Tetrahydrofolat (THF) zur Biosynthese der Folate:

N-10-Formyl-THF (Purin-Nukleosid Synthese)

5,10-Methylen-THF (Thymidinsynthese und 5-Methyl-THF-Synthese) 

 

Fettstoffwechsel

Umwandlung des Endprodukts Propionyl-CoA aus der Metabolisierung von Fettsäuren mit ungerader Anzahl von C-Atomen zu Succinyl-CoA

Abbau des verzweigten Kohlenstoffgerüsts der lipophilen Aminosäuren Valin, Leucin und Isoleucin zu Succinyl-CoA.

Biosynthesen und Energiegewinnung ausgehend vom Zitratzyklus:

Zulieferung von Succinyl-CoA an den Zitratzyklus (anaplerotische Reaktion)

 

 

 

Methioninsynthase: Mechanismus

Die Methioninsynthase ist Teil des Synthesewegs vom S-Adenosylmethionin (SAM), dem Kosubstrat der meisten Methyltransferasen. 

Methylcobalamin ist der Kofaktor der Methioninsynthase. 

Die Reaktionen folgen dem Mechanismus einer "nukleophilen Substitution am gesättigten C-Atom" (SN2 s. Grafik).

1. Die nucleophile Sulfohydrylgruppe des Homocysteins greift die Elektronenpaarbindung des Methylcobalamins an. Dabei wird die Bindung heterolytisch gespalten. Die Methylgruppe bildet mit Homocystein Methionin, die beiden Bindungselektronen bleiben beim Cobalamin, das Cobalt-Ion geht somit vom dreifach-positiven (Co3+)  in den einfach-positiv geladenen Zustand (Co1+) über und wird dadurch zu einem starken Nucleophil. Für die zweite nukleophile Substitution liefert die N5-Methylen-Tetrahydrofolatreduktase das Substrat N5-Methyltetrahydrofolat. Die Elektronenpaarbindung zwischen dem Pteridinring des Folats und der Methylgruppe wird heterolytisch gespalten, die Elektronen verbleiben im Pteridinringsystem. Das Co1+ liefert die beiden Bindungselektronen für das Methylcobalamin und das Co-Ion wird wieder zu Co3+.  

Mechanismus der Methioninsynthase

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Methylmalonyl-CoA-Mutase: Mechanismus

Das Enzym ist in den Mitochondrien lokalisiert. Beim Abbau der Aminosäuren Valin, Leucin, Isoleucin und dem ungradzahliger Fettsäuren ist das Endprodukt Propionyl-CoA. Das wird carboxyliert zu D-Methylmalonyl-CoA und dann isomerisiert zu L-Methylmalonyl-CoA.

Die B12-abhängige Mutase wandelt L-Methylmalonyl-CoA zu Succinyl-CoA um (s. Grafik). Succinyl-CoA wird als energiereiche Verbindung im Zitratzyklus weiter verwertet, denn der Schritt von Succinyl-CoA zum Succinat liefert ein Molekül ATP oder GTP. Der Zitratzyklus als ganzes produziert u. a.  den Wasserstoff für die Atmungskette in Form von NADH und FADH. 

Bei Vitamin-B12-Mangel kann die Methylmalonyl-CoA-Mutase kein Succinyl-CoA bilden und Methylmalonsäure wird ohne Enzymbeteiligung freigesetzt. Methylmalonsäure (MMA) im Blut oder Urin gehört zu den Laborparametern, die sich zum Nachweis von Vitamin-B12-Mangel eignen.

Die Methylmalonyl-CoA-Mutase ist eine  Isomerase: Sie katalysiert den Austausch von Wasserstoff gegen Coenzym-A im gleichen Molekül. Der Wasserstoff und Coenzym-A sind an benachbarte C-Atome gebunden.  

Synthese von Succinyl-CoA aus Methylmalonyl-CoA

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1. Ausgangszustand: 5‘-Desoxyadenolsyl-Cobalamin. Das Kobalt-Ion im Corrinring des Cobalamins ist dreiwertig (Co3+) und an die die 5‘-Methylgruppe des Liganden 5‘ Desoxyadenosin gebunden.

2. Die Bindung zwischen dem Kobalt im Corrinring und dem 5‘ Desoxyadenosin-Rest wird homolytisch (also durch Trennung des Elektronenpaars) gespalten. Es entsteht ein Cobalamin mit Co2+ und ein 5‘-Desoxyadenolsyl-Radikal. 

3. Das 5‘-Desoxyadenolsyl-Radikal entzieht der Methylgruppe des Substrats Methylmalonyl-CoA ein Wasserstoff-Atom (also ein H mit (s)einem Elektron). Es entsteht 5‘ Desoxyadenosin und das Substratradikal (Methylmalonyl-CoA-Radikal).

4. Das Methylmalonyl-CoA-Radikal lagert sich um: Die CO-S-CoA-Gruppe setzt sich an die Position des Radikals an der Methylgruppe, tauscht also den Platz mit dem ungepaarten Elektron.

5. Es entsteht das Produktradikal (Succinyl-CoA-Radikal).

6. Das entzieht der 5‘-Methylgruppe des 5‘-Desoxyadenosins ein Wasserstoffatom, es entsteht das Reaktionsprodukt Succinyl-CoA…

7. …und wieder ein 5‘-Desoxyadenolsyl-Radikal.

8. Das 5‘-Desoxyadenolsyl-Radikal geht mit dem Co2+-Cobalamin eine Bindung ein. Das zweite Elektron der Elektronenpaarbindung liefert das Kobalt-Ion, es wird zu Co3+. Der Ausgangszustand ist wieder hergestellt.

Gherasim C, Lofgren M, Banerjee R. Navigating the B(12) road: assimilation, delivery, and disorders of cobalamin. J Biol Chem 2013;288(19):13186-93. 

Jost M, Cracan V, Hubbard PA, Banerjee R, Drennan CL. Visualization of a radical B12 enzyme with its G-protein chaperone. Proc Natl Acad Sci U S A 2015;112(8):2419-24.

 

Tabelle: B12-Komplementationsgruppen (intrazelluläre Genprodukte betroffen)

Station

Proteine

Komplementationsgruppen

Genetisch bedingte Defizite

Transport aus dem Lysosom ins Zytoplasma

 

LMBD1 Transmembranprotein

cblF

 

ABCD4 Transportprotein

cblJ

 

Cobalamine gelangen nicht aus dem Lysosom ins Zytoplasma

Aufnahme von Cobalamin im Zytoplasma

MMACHC

Bindet Methyl-, Adenosyl-, Cyano-, Hydroxyl-Cobalamime

(base-off)

Kann Co-C-Bindungen abhängig vom beta-Liganden homo- und heterolytisch spalten

cblc

Patienten können weder Methyl- noch Adenosyl-Cobalamin bilden. Labor: Homocystinurie (HCU) und Methylmalonylacidurie (MMAU)

Unterstützt wahrscheinlich den Transfer der Cobalamine in Richtung der beiden Synthesewege in Zytoplasma bzw. Mitochondrien

MMADHC

Bindet Cobalamine nicht direkt, interagiert mit Glutathion

cblD

Labor: je nach Mutation HCU und MMAU oder nur einer der beiden Parameter erhöht

Methylierung von Homocystein zu Methionin

MS

Methioninsynthase

cblG Labor: HCU

Reduktion von durch Oxidation entstandenem Co2+ mittels reduktiver Methylierung mit NADPH, FAD2 und
S-Adenosylmethionin zu Co+-CH3, also Methylcobalamin

MSR

Methioninsynthase-Reduktase

cblE Labor: HCU

Synthese von 5‘-Adenosylcobalamin

Einbau in die Methylmalonyl-CoA-Mutase

ATR

ATP-abhängige Co+-Adenosyltransferase (Reduktionsweg Co2+ zu Co+ ungeklärt)

cblB

Isomerisierung von Methylmalonyl-CoA zu Succinyl-CoA

MCM

Methylmalonyl-CoA-Mutase

mut

MMAU Typ A

Erhöht die MCM-Enzymaktivität,

Entfernt inaktives  Co2+-Adenosylcobalamin und kooperiert dann mit der ATR zur Reaktivierung der MCM

MMAA

P-Loop-GTPase (Chaperone)

 

cblA

MMAU Typ A